De: Roberto Patarca y Mary Ann Fletcher
Departmentos de Medicina, y Microbiología e Inmunología, Escuela de Medicina
de la Universidad de Miami, Laboratorio E.M. Papper de Inmunología Clínica,
P.O. Box 016960 (R-42), Miami, FL 33101
RESUMEN
Las sales de benzalconio comprenden un grupo de alquilaminas biocidas con la fórmula general cloruro o bromuro de alquildimetilbenzilamonio las cuales están cargadas positivamente, son activas sobre membranas biológicas, y son usadas frecuentemente en soluciones dermatológicas y oftalmológicas.
Estas sales tambien afectan proteínas que interactúan con el nucleótido de guanina trifosfato (proteínas G), y por tanto interfieren con la transducción de señales en una variedad de tipos y procesos celulares.
El presente artículo resume la investigación de ciencia básica y las aplicaciones y manifestaciones clínicas de las sales de benzalconio, con énfasis paticular en una preparación de bromuro de laurildimetilbenzilamonio conocida como K-ODONTO PLUS.
Las sales de benzalconio tienen efectos antiproliferativos sobre una variedad de células a través de procesos dependientes de proteínas G, y hemos demostrado que K-ODONTO PLUS afecta, de manera negativa y dependiente de la dosis, la actividad proliferativa inducida por mitógenos de linfocitos T y B.
A pesar de que no afecta en forma aparente la expresión relativa de marcadores de superficie en celulas inmunes, K-ODONTO PLUS afecta la expresión de genes de citoquinas, probablemente como reflejo de una dependencia variable de procesos mediados por proteínas G. Además, K-ODONTO PLUS no afecta la actividad citotóxica de las células asesinas naturales (NK) contra células blanco K562 las cuales han sido reportadas de ser insensibles a anticuerpos anti-Gs.
Ensayos in vitro demostraron que, a diferencia de otras sales de benzalconio, K-ODONTO PLUS no es un irritante cutáneo u ocular, una observación la cual es consistente con su actividad moduladora negativa sobre la expresión de las citoquinas quimotácticas IL-5 e IL-8 y de las citoquinas proinflamatorias IL-6 y TNF-a. Al igual que otras sales de benzalconio, K-ODONTO PLUS es un agente bactericida, fungicida y viricida efectivo con potencial inhibitorio multifocal (directo y mediado inmunológicamente) sobre muchos patógenos, incluyendo el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), el papilomavirus, y los virus herpes.
La sal de benzalconio en K-ODONTO PLUS en las concentraciones apropiadas no sólo es efectiva como desinfectante y potencialmente como espermicida sino que tambien puede ser útil en la prevención y tratamiento de neoplasias, particularmente aquellas ligadas a virus y presentes en la piel o en mucosas.
I. Las sales de benzalconio y los procesos mediados por proteínas G
A. Proliferación celular
El término cloruro de banzalconio, tal como es utilizado en la literatura y en este artículo, se refiere a una mezcla de sales de amonio cuaternarias, los cloruros de benzildimetilamonio. El cloruro de banzalconio es un activador de las proteínas heterotriméricas regulatorias que interactúan con el nucleótido guanina (proteínas G).
Otros activadores no relacionados estructuralmente de estas proteínas incluyen el fluoruro de aluminio (Vitale et al., 1993), el péptido mastoparán en el veneno de avispa (Emadi-Khiav et al., 1995; Vitale et al., 1993), la toxina de la tos ferina (Estevez et al., 1994; Mously y Landry, 1994; Mousli et al., 1995), y la toxina del cólera (Estevez et al., 1994). Estos ultimos activadores y las sales de benzalconio actúan a través de una variedad de proteínas G y de sus subunidades en cada sistema ensayado.
Existe amplia evidencia sobre la participación de las proteínas G en el crecimiento y diferenciación de varios tipos celulares (Gallo et al., 1995; Kinane et al., 1995; Strader et al., 1994), y el cloruro de benzalconio, en concentraciones comúnmente usadas en varias situaciones clínicas, tiene un efecto antiproliferativo sobre células de linfoma múrido (Withrow et al., 1989), fibroblastos humanos (Damour et al., 1992), fibroblastos de cápsula de Tenón humanos (Cunliffe et al., 1995a,b), células V79 (Kajino, 1987), células de red trabecular humana (Samples et al., 1989), y queratinocitos humanos y de rata (Damour et al., 1992; Eun et el., 1994; Fabreguette et al., 1994; Muller-Decker et al., 1994).
Por otra parte, se ha demostrado que el bromuro de cetiltrimetilamonio en dosis bajas estimula la actividad proliferativa y el metabolismo mitocondrial de queratinocitos (Bigliardi et al., 1994), y que el cloruro de banzalconio al 1% no afecta la mitosis de células epidérmicas mientras que al 5% produce un incremento de diez veces en la actividad mitótica (Fisher and Maibach, 1975).
Estos incrementos paradójicos en la actividad proliferativa después de exposición a larga plazo a sales de benzalconio pueden ser secundarios a efectos irritantes con inflamación consecuente y no a estimulación directa (Williams et al., 1992). Por ejemplo, se ha demostrado que el cloruro de banzalconio estimula la proliferación de células epiteliales del intestino delgado en vellos y criptas, probablemente debido a sus efectos deletéreos sobre el plexo mientérico (Holle, 1991).
En relación a la fase del ciclo celular afectada por el clouro de benzalconio, grabaciones videomicrográficas contínuas de intervalos de tiempo y microscopia de contraste de fase secuencial han demostrado que exposición de cultivos primarios de células epiteliales de cornea humana al cloruro de benzalconio (0.01%) causa un arresto inmediato de la citoquinesis normal y de la actividad mitótica resultando en degeneración celular en 2 horas (Tripathi and Tripathy, 1989).
Este ultimo efecto parece reversible porque celulas conjuntivales humanas de Chang en cultivo recobraron la actividad proliferativa 48 horas después que histogramas de DNA habían mostrado inhibición de la fase sintética del ciclo celular (Takahashi et al., 1992). Ademas, estudios en celulas de red trabecular bovina revelaron poco cambio en la organización de vimentina y actina y en la condensación de las fibras citoesqueléticas después de exposición al cloruro de benzalconio (Kawa et al., 1993).
Es importante resaltar que, a pesar de su efecto inhibitorio sobre la fase sintética de DNA y en distinción a los efectos de otros desinfestantes como el gluteraldehido y el acrinol, el cloruro de benzalconio no ha demostrado ser genotóxico en los ensayos umu, rec líquido y Ames (Sakagami et al., 1988).
A pesar de que, al ser ensayado para mutagenicidad en cuatro cepas de Salmonella, el cloruro de benzalconio es activo bajo condiciones de incubación en la oscuridad, una actividad la cual es aumentada cuando los viales son irradiadios con luz visible (Lovely et al., 1982), el daño al ADN causado por el cloruro de benzalconio es reparable tal como se demostró en el ensayo de ADN polimerasa A- en E. coli (Lovely et al., 1982).
Los experimentos reseñados en la Figura 1 muestran que la sal de bromuro de benzalconio en K-ODONTO PLUS inhibe, de manera dependiente de la dosis, la proliferación de células mononucleares de sangre periférica (PBMC: Peripheral Blood Mononuclear Cells) en respuesta al mitógeno dependiente de célula T fitohemaglutinina (comúnmente conocido por sus siglas inglesas PHA: PhytoHemAgglutinin) y al mitógeno de la fitolaca dependiente de célula B (PWM, PokeWeed Mitogen en ingles).
Las concentraciones de inhibición media máxima (IC50) de K-ODONTO PLUS en los ensayos de proliferación PHA y PWM son de 0.025%. A pesar del efecto antiproliferativo de K-ODONTO PLUS, no se observaron cambios en las proporciones de células expresando distintos marcadores de superficie (CD2, CD3, CD4, CD5, CD8. CD11a, CD19, CD20, CD29, CD45RA), incluyendo marcadores de activación (CD26, HLA-DR), tanto en condiciones libres de estimulación (medio de crecimiento solamente) o de estimulación mitogénica (Figura 2).
La falta de efecto de K-ODONTO PLUS sobre las proporciones de células linfoideas es tambien confirmada incubando sangre periférica por cuatro horas con distintas concentraciones de K-ODONTO PLUS (Figura 3). En tal sentido, las proporciones de células T que expresan el complejo asociado al receptor de célula T CD3, CD2, o el pan-marcador de célula T CD5, de células que expresan el marcador de activación CD26 (CD3+CD26+, CD2+CD26+), de subpoblaciones de células T (CD4+ y CD8+), de subpoblaciones de células T CD4+ (CD4+CD45RA+ y CD4+CD29+), de subpoblaciones de células T CD8+ (CD8+CD11a+ y CD8+HLA-DR+), y de células B (CD19+ y CD20+) permanecen inalteradas aún a concentraciones de K-ODONTO PLUS que causan inhibición total de la actividad linfoproliferativa.
Estas observaciones sugieren que K-ODONTO PLUS no afecta negativamente la viabilidad de subpoblaciones particulares de células linfoideas y que las porporciones relativas de estas células se mantienen a pesar de la inhibición de la actividad proliferativa mediada por K-ODONTO PLUS. Es posible que la expresión de marcadores de activación probados sea proximal al estadío de ciclo celular afectado por K-ODONTO PLUS y que la proporción de células expresando otros marcadores de activación sea afectada.
En relación al efecto inhibitorio de K-ODONTO PLUS sobre la linfoproliferación a través de posibles interacciones con proteínas G, cabe resaltar que una proteína G sensible a la toxina del cólera regula la proliferación de celulas T (Li et al., 1994). Además, un mecanismo mediado por un receptor acoplado a una proteína G sensible a la toxina de la tos ferina es reponsable de la inhibición por parte de compuestos canabinoides (marijuana y delta-9-tetrahidrocanabinol) de las respuestas de proliferación linfocitaria a PMA más ionomicina y de las respuestas celulares de formación de anticuerpos IgM dirigidas contra eritrocitos de oveja (Burstein et al., 1004; Kaminski et al., 1994).
La hiporeactividad a largo plazo de células T después de estimulación a través del receptor de antígeno puede tambien resultar de la transducción de señales acoplada a proteína G (Dubois et al., 1994). En tal respecto, la perturbación del complejo de receptor de antígeno de linfocito T/CD3 o la estimulación por forbol ester de células T Jurkat conlleva a la activación de fosfolipasa D, probablemente secundaria a la activación de proteína quinasa C (Stewart et al., 1993) o a un mecanismo mediado por proteína G ya que una proteína G de 68-kDa, la cual es insensible a las toxinas del cólera o de la tos ferina, ha sido asociada específicamente con el complejo receptor de célula T/CD3 (Ohmura et al., 1992).
Otra evidencia de la participación de la senalización por proteína G en la activación de célula T viene de estudios del H12.3, un gen que pertenece a la familia de subunidades b de proteínas G, la expresión del cual es inducida en la fase tardía de estimulación mitogénica de células T y B (Shan et al., 1994).
Además de la proliferación, las proteínas G están involucradas en otros procesos asociados con las células T. Por ejemplo, se ha demostrado que un evento rápido de activación de linfocito mediado por un receptor que involucra señalizacion por proteína G sensible a la toxina de la tos ferina conlleva a la adhesión estable de linfocitos a las venulas endoteliales altas (VEA) in vivo y puede jugar un papel en la regulación de la compartamentalización de linfocitos (Bargatze and Butcher, 1993).
En tal sentido, análisis de video microscópico in situ de las interacciones de linfocitos con VEAs en placas de Peyer exteriozadas de ratón reveló que, a pesar de que la toxina de tos ferina no afecta el "revuelco" mostrado por muchos linfocitos, inhibe un evento de "fijamiento" dependiente de activación requerido para detener al linfocito circulante (Bargatze and Butcher, 1993).
Receptores acoplados a proteína G codificados o inducidos por virus que son relevantes a la función y activación linfocitarias y a la replicación viral pueden ser tambien sensibles a las sales de benzalconio. Por ejemplo, el herpesvirus 2 equino (EHV-2) codifica tres receptores potenciales acoplados a proteína G, uno con un equivalente en herpesvirus saimiri el cual es específico para las quimoquinas a, otro con un equivalente en el citomegalovirus humano el cual es específico para las quimoquinas b, y un tercero el cual adolece de equivalentes en otros virus herpes (Gao and Murphy, 1994; Telfored et al., 1995).
Además, la infección de células B con otro virus herpes, el virus de Epstein-Barr (EBV), induce la expresión de receptores acoplados a proteína G, uno relacionado cercanamente a los receptores de interleucina (IL)-8 y el otro al receptor de trombina, los cuales probablemente son mediadores tanto de los efectos de EBV sobre los linfocitos B como de funciones linfocitarias normales (Birkenbach et al., 1993; Schweickart et al., 1994). En tal sentido, se ha demostrado que el receptor BLR1 (Receptor de Lymphoma de Burkitt 1) el cual está acoplado a proteína G BLR1 y es similar al receptor de IL-8 (Dobner et al., 1992), define y controla funcionalmente la migración y activación de células B recirculantes maduras y de una subpoblación de células T ayudadoras memoria (Forster et al., 1994).
Una forma alterna de BLR1, MDR15, ha sido tambien identificada y sugiere la existencia de quimoquinas no identificadas hasta el momento (Barella et al., 1995). Probablemente en la misma superfamilia de proteínas, una molecula de superficie acoplada a proteína G denominada fusin, la cual comparte 37% de identidad a nivel de aminoácido con el receptor de IL-8, ha sido identificada como cofactor para la entrada a la célula de cepas linfotrópicas de VIH (Feng et al., 1996).
Además, un receptor de quimoquina funciona como el cofactor de entrada a los macrófagos de cepas monotrópicas primarias de VIH (Deng et al., 1996; Drajic et al., 1996). Estas observaciones abren la posibilidad de que sustancias como K-ODONTO PLUS que interactúan con proteínas G inhiban la entrada del VIH a las células.
B. Expresión de genes de citoquinas
K-ODONTO PLUS inhibe la liberación de factor de necrosis tumoral (TNF)-a por parte de PBMCs estimulados con PHA ó PWM (Figure 4), lo cual es consistente con el hecho de que una proteína G sensible a la toxina del cólera, junto con una proteína quinasa dependiente de calmodulina y una proteína tirosina quinasa, está involucrada en la liberación de TNF-a por parte de monocitos humanos tras inducción por tanto peptidoglicano como lipopolisacárido de Staphylococcus epidermidis (Mattson et al., 1996).
Tambien se ha demostrado que la liberación de TNF-a es inhibida por la pentoxifilina [Trental; 3,7-dimethyl-1-(5-oxohexyl) xantina], la cloroquina, y el antioxidante apocinina (Mattson et al., 1996). Debido a que la unión del VIH-1 al receptor CD4 induce la expresión de TNF por parte de PBMCs el cual, a su vez, potencia la replicación viral (Merrill et al., 1989; Vyakarnam et al., 1990), estimula la actividad linfoproliferativa de células T (Tartaglia and Goeddel, 1992), y disminuye la eficacia terapeutica de la zidovudina (azidotimidina, AZT), la inhibición de la liberación de TNF por parte de K-ODONTO PLUS puede contribuir a la inhibición de tanto la linfoproliferación como de la replicación del VIH.
En tal sentido, se ha demostrado que la pentoxifilina inhibe la liberación de TNF, tiene actividad contra la replicación del VIH, y es beneficiosa en pacientes con cáncer (Fazely et al., 1991).
En contraste con su efecto sobre la expresión de TNF-a, K-ODONTO PLUS induce la producción de IL-1b por parte de PBMCs estimulados con PHA pero no afecta la producción de IL-1b por parte de PBMCs en respuesta a PWM (Figura 4). En tal sentido, cabe resaltar que se ha demostrado que el cloruro de benzalconio induce la producción intracelular de IL-1a sin liberación concomitante al medio de cultivo por parte de queratinocitos humanos (Wilmer et al., 1994).
A pesar de que las proteínas G también están involucradas en la transducción de señales asociadas a IL-1, dicha señalización puede incluir mecanismos distintos a los receptores acoplados a proteína G convencionales (Ray et al., 1992).
La migración de leucocitos neutrófilos a focos inflamatorios es importante para la eliminación de microorganismos. La respuesta quimotáctica inicial es mediada por quimoatrayentes clásicos como el formil-Met-Leu-Fen o quimoquinas como IL-8 y RANTES las cuales se unen a receptores con siete porciones transmembrana y acoplados a proteína G (Ahuja et al., 1992; Bacon et al., 1995; Bischoff et al., 1993; Fan and McCloskey, 1994; Kemeny et al., 1994; Mukaida, 1992; Rot et al., 1992; Thelen et al., 1995; Wu et al., 1993). IL-8 es producida en respueta a estímulos inflamatorios tales como lipopolisacárido, IL-1, y TNF (Mukaida, 1992; van Deventer et al., 1993).
Consistente con su efecto predominantemente inhibitorio sobre la expresión de TNF-a por parte de PBMCs estimulados con PHA y PWM y con su efecto estimulatorio sobre la expresión de IL-1a por parte de PBMCs activados con PHA, la presencia de K-ODONTO PLUS durante la estimulación mitogénica de PBMCs tiene un efecto ligeramente inhibitorio sobre la producción de IL-8 (Figura 5) lo cual puede afectar la quimotaxis de leucocitos.
En tal sentido, se ha demostrado que el cloruro de banzalconio, en concentraciones de 0.8 mg/l, es perjudicial a la quimotaxis de granulocitos humanos (Hakansson et al., 1989) y que, dependiendo de la concentracion y el tiempo de incubación, tiene un efecto perjudicial sobre la polimerización de actina, la fagocitosis y los procesos oxidativos en neutrófilos humanos (Bjerknes and Steinsvag, 1993). La inhibición de la función granulocítica no es absoluta ya que, en otro estudio, el cloruro de banzalconio (0.1% peso/volumen) causó un incremento de cinco vences en la actividad de elastasa en leucocitos humanos expuestos a sustratos de 4-nitroanilida (Wenzel et al., 1990), y estudios en células de red trabecular bovina mostraron poco cambio en la organización de la vimentina y actina y en la condensación de fibras citoesqueléticas después de incubación con cloruro de benzalconio (Kawa et al., 1993).
Sin embargo, se espera que la modulación negativa de la expresión de IL-8 resulte en una disminución de la migración de leucocitos a focos de inflamación, una observación la cual es consistente con la falta de efecto irritante de K-ODONTO PLUS después de inyección subcutánea, exposición cutánea, o aplicación conjuntival en conejos.
Debido a que TNF-a e IL-8 tienen actividad angiogénica (Fajardo et al., 1992; Koch et al., 1992; Leibovich et al., 1987; Fajardo et al., 1992; van Deventer et al., 1993), la inhibición de su producción mediada por K-ODONTO PLUS puede ser relevante a la prevención y/o tratamiento de procesos angiogénicos asociados a microbios tales como el sarcoma de Kaposi, la bartonelosis o verruga peruana, y la angiomatosis bacilar (Abrams and Farhood, 1989; Cáceres-Ríos et al., 1995; Cockerell et al., 1987, 1990, 1991; Dealler, 1988; Goldman, 1989; LeBoit et al., 1988; Relman et al., 1992; Stoler et al., 1983). K-ODONTO PLUS puede afectar varias rutas relacionadas a la angiogenesis porque TNF-a induce la expresión de c-ets 1 (Wernert et el., 1992) y B61 (Pandey et al., 1995) en células endoteliales al igual qie la liberación de mediadores secundarios, tales como las prostaglandinas (Fajardo et al., 1992) y el factor de activador de plaquetas (1-O-alkyl-2-acetil-sn-glicero-3-fosfocolina (Camussi et al., 1995; Montrucchio et al., 1994).
En tal sentido, se cree que c-ets 1 regula la transcripción de genes que codifican proteasas degradadoras de matriz necasarias para angiogenesis (Wernert et al., 1992), y B61 es un producto de gen de célula endotelial el cual es angiogénico y también puede funcionar como quimotaxina de celula endotelial a través de su interacción con la tirosina quinasa del receptor Eck de célula endotelial (Pandey et al., 1995).
El factor angiogénico y quimotáctico IL-8 y las citoquinas IL-6, IL-3, y TNF-b también modulan, a través de la interacción con proteínas G, la formación de leucotrienos inducida por formil-Met-Leu-Fen en neutrófilos (Brom and Konig, 1992). Por tanto, el efecto inhibitorio de K-ODONTO PLUS sobre la producción, activada por PWM, de IL-6 e IL-3 y sobre la producción, activada por PHA, de IL-3 por parte de PBMCs (Figuras 4 y 5) puede afectar la función neutrofílica.
Además, IL-3 estimula la supervivencia y proliferación de líneas celulares precursoras multipotenciales indirectamente a través de proteína(s) G sensible a la toxina de la tos ferina (Akisanya and Whetton, 1992), y las células mastoideas dependientes de IL-3 portan una proteína G sensible a la toxina de la tos ferina acoplada al receptor de prostaglandina (Nishigaki et al., 1993).
Por tanto, la modulación negativa de IL-3 por parte de K-ODONTO PLUS puede también estar involucrada en la inhibición de la liberación de histamina por parte de células mastoideas (ver abajo), nuevamente consistente con la falta de efecto irritante de K-ODONTO PLUS.
También analizamos los efectos de K-ODONTO PLUS sobre la expresión de citoquinas asociada a células T. K-ODONTO PLUS no altera la expresión de IL-4 ó HLA-DR en PBMCs activados por PHA ó PWM (Figuras 2 y 5), lo cual es consistente con la observación de que IL-4 aparentemente induce la expresión de HLA-DR en monocitos normales humanos o en células blanco de leucemia M2 también a través de una ruta de señalización mediada por proteína G (Vassiliadis and Papamatheakis, 1992).
K-ODONTO PLUS también inhibe, de una manera dependiente de la dosis, la producción de IL-2 e IL-5 por parte de células T en PBMCs estimulados con PHA (Figura 5). Se espera que la inhibición de producción de IL-5 mediada por K-ODONTO PLUS también sea relevante a la inhibición de respuestas inflamatorias locales pues IL-5 induce la diferenciación y proliferación de eosinófilos en médula ósea, activa eosinófilos y prolonga su supervivencia in vitro (Clutterbuck and Sanderson, 1988; Coeffier et al., 1991; Collins et al., 1995; Sanderson et al., 1985; Sehmi et al., 1992; Tai et al., 1991; Warringa et al., 1992; Yamaguchi et al., 1988), y estimula la producción de quimoatrayentes de linfocitos por parte de eosinófilos humanos (Lim et al., 1996).
En resumen, la inhibición mediada por K-ODONTO PLUS de la producción de IL-5, IL-8, IL-3 y de las citoquinas proinflamatorias IL-6 y TNF-a por parte de PBMCs activados es consistente con su falta de effecto irritante en ensayos Draize y en otras pruebas.
C. Exocitosis de gránulos y funciones de células citotóxicas T, asesinas naturales, mastoideas y neuronales.
Las proteínas que interactúan con GTP juegan un papel importante en el control de la exocitosis. Por ejemplo, clones de linfocitos T citotóxicos CD8+ permeabilizados con la toxina a de Staphylococcus aureus pueden ser estimulados a liberar los contenidos de sus gránulos por exocitosis en respuesta al 5'-(gamma-tio)trifosfato (GTP gamma S) (Mittrucker and Fleischer, 1992). El usode varios inhibidores que actúan en las fases tempranas de la activación de células T ha revelado que la proteína G que afecta a la exocitosis está localizada distalmente en la cascada de eventos después de la activación de células T (Mittrucker and Fleischer, 1992). Por ejemplo, el inhibidor de proteína quinasa C, estaurosporina, y los inmunosupresores ciclosporina A y FK-506 y genisteína, un inhibidor de tirosina quinasas, todos inhiben la liberación de esterasa activada en células intactas por anticuerpos anti-receptor de célula T pero no la liberación inducida por GTP gamma S en células permeabilizadas. La ciclosporina A, FK-506, y genisteína también bloquean la exocitosis inducida en células intactas por una combinación de forbol ester e ionóforo de calcio A23187.
Además, la citocalasina B, un inhibidor de la polimerización de actina, inhibe la exocitosis en células intactas pero aumenta la exocitosis en células permeabilizadas.
Las células asesinas naturales (células NK) son una subpoblación de linfocitos que mata a células infestadas por virus y células tumorales sin sensitización previa (Patarca et al., 1996). La participación de una proteína G en la exocitosis granular en células NK es también demostrada a través de la permeabilización de dichas células e incubación con GTP gamma S e IL-2 ó IL-12 (Bonnema et al., 1994). En tal sentido, la introducción de anticuerpos anti proteína Gs dentro de células NK activadas por IL-2 y permeabilizadas con streptolisina O (celulas IANK) inhibe el asesinato celular de células blanco RAJI NK-resistentes/IANK-sensibles pero no de células blanco K562 NK-sensibles (Maghazachi and Al-Aoukaty, 1994).
Las células K562 y RAJI inducen la liberación de ao, ai, as o aq.11 de membranas de células IANK, lo cual sugiere que los receptores potenciales que reconocen las células blanco K562 o RAJI están acoplados a Go en células IANK, pero solo aquellos que reconocen a las células RAJI están acoplados con Gs (Maghazachi and Al-Aoukaty, 1994). Tal como lo ilustra la Figura 6, en concentraciones de hasta 0.025%, K-ODONTO PLUS no afecta la actividad citotóxica de células NK intactas sobre células blancos K562 NK-sensibles, lo cual sugiere que la proteina Go que puede estar acoplada al receptor de K562 es insensible al bromuro de benzalkonio.
Habría que determinar si la proteína Gs acoplada a los receptores de RAJI es sensible a K-ODONTO PLUS. Las concentraciones de K-ODONTO PLUS superiores a 0.025% causan la lisis no relacionada células NK de las células blanco K562 a través de su actividad sobre membranas tal como se verificó en experimentos usando solamente células blanco K562.
Varias líneas de evidencia señalan otras interacciones entre las sales de benzalconio y las proteínas G involucradas en la regulación de la exocitosis. En tal sentido, se ha demostrado que el cloruro de benzalconio, a través de la activación de una proteína inhibitoria Go posiblemente localizada en la membrana de granulos secretorios, inhibe la secreción de catecolamina evocada por calcio en células cromafina permeabilizadas con estreptolisina O (Vitale et al., 1993). Además, las proteínas que interactúan con GTP son también focos primarios de la acción de los liberadores peptídicos de histamina en células mastoideas.
La anafilotoxina C3a y sus análogos (C3adesArg o péptidos C-terminales de C3a) estimulan la liberación de histamina por parte de células mastoideas peritoneales de rata a través de una ruta dependiente de proteína G la cual es sensible a la inhibición por cloruro de benzalconio, tal como se evidencia por la generación disminuida de polifosfatos de inositol (Mousli et al., 1992).
El neuropéptido Y (NPY) también activa a las células mastoideas a través de un proceso el cual se cree que es inespecífico, posiblemente a través de la interacción con residuos de ácido siálico en la superficie celular seguida por la activación de una proteína G heterotrimérica. El pretratamiento con cloruro de benzalconio o con toxina de la tos ferina también inhibe los efectos liberadores de histamina del NPY, péptidos relacionados al NPY, y mastoparán en células mastoideas cutáneas humanas y de rata (Emadi-Khiav et al., 1995; Grundemar et al., 1994; Mousli and Landry, 1994; Mousli et al., 1995).
La liberación de histamina puede ser inducida por el compuesto 48/80, otras poliaminas (cadaverina, putresina, hexametonio, decametonio, lisina, dilisina, trilisina, pentalisina, melitina, pentamidina, espermidina, espermina, morfina, norepinefrina, tiramina y 5-hidroxitriptamina), sustancia P, bradiquinina, somatostatina, corticotropina 1-24, péptido intestinal vasoactivo, y una secuencia decapeptídica de IgE. Tal como en el caso de NPY y C3a, tal liberación de histamina es también inhibida significativamente por la toxina de la tos ferina, la toxina del cólera, el cloruro de benzalconio, y la neuraminidasa de Vibrio comma (Bueb et al., 1992; Coleman, 1982; Estevez et al., 1994; Kurose and Saeki, 1981; Piotrowski and Foreman, 1985; Read et al., 1982).
Además, el cloruro de benzalconio inhibe la liberación, inducida por el decapéptido de inmunoglobulina E (dominio C4) y la poliarginina, de 5-hidroxitriptamina por parte de células peritoneales de rata (Coleman et al., 1981). Este ultimo efecto del cloruro de banzalconio no está probablemente limitado a rutas peptidérgicas en células mastoideas y también puede extenderse a exocitosis granular en neutrófilos con receptores para C5a y quimoquinas (Gerard and Gerard, 1994; Smith et al., 1995), neuronas peptidérgicas (Fox et al., 1983), y células que responden a la melatonina (Bubis and Zisapel, 1995).
Los estudios de Fischer et al. (1993) y de Read et al. (1982) han ilustrado los efectos de variantes de estructura de sales de benzalconio sobre la actividad liberadora de histamina en células mastoideas. Fischer et al. (1993) demostraron que la liberación de histamina inducida por GTP gamma S y por mastoparán es inhibida por el pretratamiento de células mastoideas peritoneales de rata con 0.1 a 3 mg/ml de una mezcla de cloruro de benzalconio consistente predominantemente de una cadena alifática de 12 átomos de carbono.
Un compuesto con una cadena alifática de 14 átomos de carbono [BAC(C14)] a una concentración de 5 a 10 mM también inhibe la liberación de histamina inducida por GTP gamma S y mastoparán. Se han obtenido resultados similares con otra alquilamina, el bromuro de tetradeciltrimeilamonio [TAB9C14)], el cual difiere de BAC9C14) en la ausencia del anillo de benzeno. La presencia del radical fenilo es por tanto prescindible para el efecto inhibitorio de BAC. BAC(C12) y BAC(C14) inhiben la generación de polifosfatos de inositol inducida por GTP gamma S, mientras que BAC(C12) y TAB(C14) inhiben la actividad de GTPasa estimulada por mastoparán por proteínas Gi-similares en células mastoideas.
Estos resultados sugieren que las alquilaminas ejercen selectivamente su efecto inhibitorio a través de una interacción con proteínas Gi-similares de células mastoideas acopladas a fosfolipasa C, es decir, en una fase temprana en el proceso de acoplamiento estímulo-secreción. Read et al (1992) también han demostrado que: la sustitución de alquilo, cicloalquilo, u otros grupos arilo por el grupo benzilo del cloruro de benzildimetiltetradecilamonio reduce la actividad solo ligeramente; la demetilación para formar aminas terciarias o secundarias reduce dramáticamente la actividad; la longitud óptima de la cadena alquilo es usualmente 12 carbones; y el reemplazo del nitrógeno por fósforo ó azufre no afecta significativemente la actividad.
La inhibición del receptor de poliamina por tanto require de compuestos, con una carga positiva permanente adherida a un medio hidrofóbico sustancial pero limitado, los cuales probablemente son capaces de contrarrestar la carga negativa de la superficie celular.
Existen otros mecanismos liberadores de histamina los cuales no son afectados por las sales de benzalconio. Por ejemplo, el agente quimoterapeutico adriamicina induce la liberación no inmunológica y no citotóxica de histamina por parte de células mastoideas peritoneales y pleurales de ratas a través de un mecanismo insensible al pretratamiento con toxina de la tos ferina, toxina del cólera, y cloruro de benzalconio (Estevez et al., 1994).
Además, el cloruro de benzalconio no inhibe la liberación de histamina causada por reacciones de antígeno-anticuerpo, ionóforos, enzimas, o detergentes (Read et al., 1982), y afecta solo ligeramente aquella inducida por neurotensina (Kurose and Saeki, 1981). Cabe resaltar, además, que las sales de benzalconio pueden tener efectos diferentes sobre exocitosis granular de compuestos no histamínicos. Por ejemplo, el cloruro de benzalconio estimula la liberación de 5-hidroxitriptamina inducida por la estimulación inmunológica de células mastoideas peritoneales de rata (Coleman et al., 1981).
Una razón de preocupación acerca del uso de sales de benzalconio en medios clínicos ha sido la observación de que, a pesar de su efecto inhibitorio sobre la liberación de histamina, varias líneas de evidencia sugieren que las sales de benzalconio pueden ser potencialmente alergógenos débiles-a-moderados (Fuchs et al., 1993) con efectos variables dependiendo de las cadenas laterales y aniones.
En tal sentido, se ha demostrado que, entre otros agentes antimicrobiales disponibles sin prescripción médica, la proflavina es el sensibilizador mas potente (4/10 coballos); el paraclorometxilenol, el cloruro de benzalconio, y el isetionato de propamidina, sensibilizadores moderados (2/10 coballos); el iodo, un sensibilizador débil (1/10 coballos); y la clorhexidina y la cetrimida sensibilizadores muy débiles (0/10 coballos) (Goh, 1989).
Además, se ha encontrado que el cloruro de benzalconio (0.025% y 0.5%) produce engrosamiento moderado de la mucosa de oído medio e inflamación y engrosamiento ligero a moderado de la membrana timpánica, aunque el primero efecto no es estadísticamente distinto de reacciones causadas por solución salina (Barlow et al., 1995). A pesar de que la inyección intraperitoneal de IL-10 en ratones no inhibió la respuesta tóxica de inflamación de oído inducida por la aplicación tópica de cloruro de benzalconio (reacción de hipersensibilidad de contacto), dicha inyección inhibió la hipersensibilidad de tipo tardía inducida por la inyección subcutánea de células de bazo acopladas a trinitrofenil de ratones sensibilizados (Schwarz et al., 1994).
Estos ultimos resultados sugieren que, a pesar de que el cloruro de benzalconio pueda inducir reacciones de hipersensibilidad de contacto o tardías, estas reacciones están relacionadas pero son distintas.
Se ha demostado también que el cloruro de benzalconio causa dermatitis de contacto irritante y alérgica en varios estudios animales y humanos (Corazza and Virgili, 1993; Cox, 1994; Cusano and Luciano, 1993; Fisher, 1987; Le Sellin et al., 1991; Lovell and Staniforth, 1981; Patrick et al., 1985; Roper and Jones, 1985; Rustemeyer et al., 1994; Staniforth, 1980; Trevisan et al., 1988; Wahlberg, 1993; Willis et al., 1986, 1988).
Estos estudios son relevantes porque el cloruro de benzalconio está presente en 3% de 1467 medicamentos administrados frecuentemente en Suiza (Kolly et al., 1989), las cuales causan 5.5% de reacciones positivas a los preservativos (Perrenoud et al., 1994), y porque existen buenas correlaciones entre los potenciales sensibilizadores en estudios animales y la experiencia clínica de alergia de contacto a agentes antimicrobianos tópicos (Goh, 1989) y entre los mas recientes estudios de toxicidad in vitro y los mas tradicionales estudios in vivo (Augustin and Damour, 1995; Jain et al., 1992; Van de Sandt et al., 1995).
Por ejemplo, se ha establecido, en conejos expuestos al cloruro de benzalconio, una relación directa entre signos clínicos de irritación y liberación in vitro del mediador proinflamatorio ácido 12-hidroxieicosatetraenoico (12-HETE) por parte de la piel expuesta (Van de Sandt et al., 1995). Otro estudio de 142 pacientes tratados por otitis externa crónica documentó que el cloruro de benzalconio o benzetonio son responsables de 6.3 al 8.5% de reacciones alérgicas (Fraki et al., 1985).
Además, un estudio en Polonia mostró que 89 de 322 (27.6%) trajadores de la salud examinados entre 1989 y 1994 eran hipersensibles a por lo menos un desinfestante, principalmente formalina, esterinol (bromuro de benzalconio), lisoformina, o cloramina (Kiec-Swierczynska, 1995). Se observó también la ocurrencia frecuente de alergia a metales (niquel, cobalto, cromo, mercurio) en personas hipersensibles a los desinfestantes (Kiec-Swierczynska, 1995).
Esta ultima observación epidemiológica es consistente con estudios que muestran que los irritantes aumentan las respuestas proliferativas de células de ganglios linfáticos en respuesta a alergógenos metálicos (Ikarashi et al., 1993).
Las concentraciones de cloruro de benzalconio para observar efectos alérgicos e irritantes han variado entre 0.5 (Kold and Knop, 1987) y 25% (Willis et al., 1988), dependiendo del estudio y de la sal utilizada. En tal sentido, el cloruro de benzalconio ha causado una alta frecuencia de reacciones pustulares y/o bulosas con cicatrización como consecuencia a su aplicación tópica en humanos (Wahlberg et al., 1985), pero, a diferencia del sulfato de laurilo sódico y el cloruro de mercurio, no ha causado pustulación en un modelo de conejo (Wahlberg and Maibach, 1981).
Además, a diferencia de los irritantes sulfato de laurilo sódico, cocobataína, crotonaldehido con sulfato de laurilo sódico, dimetil sulfóxido, e hidróxido de sodio, el cloruro de benzalconio no influenció significativamente la pérdida de vapor de agua a través de la piel, sugiriendo una ausencia de efecto sobre la capa cornuda en un estudio (Van der Valk et al., 1985).
En otros estudios, se encontró que el bromuro de dodeciltrimetilamonio y el cloruro de benzalconio aumentan la pérdida de agua transepidermal y disminuyen la hidratación del estrato córneo (Park and Eun, 1995; Wilhelm et al., 1994).
Estudios han demostrado también que los queratinocitos orales y cutáneos son sensibles al cloruro de benzalconio tal como se observa a nivel de citotoxicidad (actividad metabólica mitocondrial e integridad de membrana plasmática), liberación de ácido araquidónico, y liberación de interleucina-1a (Damour et al., 1992; Eun et al., 1994; Fabreguette et al., 1994; Muller-Decker et al., 1994).
Por otra parte, se ha demostrado que el bromuro de cetiltrimetilamonio en bajas concentraciones estimula la actividad proliferativa y el metabolismo mitocondrial de queratinocitos (Bigliardi et al., 1994), lo cual puede también conllevar a dermatitis a través de un posible aumento en la liberación de citoquinas (Bigliardi et al., 1994; Willis et al., 1992; Wilmer et al., 1994). En otro estudio, se demostró que el cloruro de benzalconio al 1% no afectó la mitosis de células epidérmicas, mientras que el cloruro de benzalconio al 5% producía un aumento de diez veces en la actividad mitótica (Fisher and Maibach, 1975).
Sin embargo, se cree que el aumento en la actividad proliferativa tras exposición a largo plazo al preservativo es secundario a la inflamación asociada a sus efectos irritantes (Williams et al., 1992). Se han documentado efectos hiperplásicos similares en capas mas profundas de la piel tal como lo evidencia el efecto hiperplasiogénico del cloruro de benzalconio, reportado como una duplicación en el conteo de sebocitos asociado con grandes aumentos en el reticulo endoplasmático y en gotas de sebo (Lesnik et al., 1992).
Los efectos diferenciales de las sales de benzalconio sobre las propriedades epiteliales son también ilustradas por experimentos en los cuales formulaciones de lidocaína fueron probadas en cuanto a su efectividad en producir anestesia después de su aplicaión tópica: la formulación con bromuro de tetradeciltrimetilamonio produjo mas anestesia que aquélla con cloruro de octadeciltrimetilamonio (Kushla et al., 1993).
Además de la dermatitis de contacto, el cloruro de laurildimetilbenzilamonio (Bernstein et al., 1994; Burge and Richardosn, 1994; Innocenti, 1978; Menendez et al., 1989; Ponder and Wray, 1993) y otros agentes limpiantes y biocidas (clorhexidina[Waclawski et al., 1989], gluteraldehido [Burge, 1989], formaldehido [Hendrick and Lane, 1975], isotiozolinonas [Rosskamp, 1990], y cloramina T [Bourne et al., 1979]), han sido descritas como causas del asma ocupacional.
El cloruro de benzalconio ha sido implicado en la broncoconstricción paradójica, evidenciada por resollido después de nebulización con el medicamento para el asma bromuro de ipatropio (Atrovent) en viales de multidosis (Beasley et al., 1987; Clark, 1986; Miszkiel et al., 1988a,b; Zhang et al., 1990). Se han atribuído tres casos de arresto respiratorio al cloruro de benzalconio en terapia de nebulización broncodilatadora (Boucher et al., 1992). La reactividad histamínica casi normal antes del reto con desinfestante en individuos sensibles, la muy pequeña exposición requerida, y la reacción asmática tardía pronunciada vistas sugieren que hipersensibilidad en vez de irritación es la responsable de las reacciones vistas, a pesar de que no se han excluido rutas nerviosas las cuales pueden ser responsables por el componente no histamínico de la respuesta.
En tal sentido, la broncoconstricción inducida por el cloruro de benzalconio puede ser provocada por una combinación de activación de célula mastoidea (tal como se evidencia por inhibición con cromoglicato sódico, terfenadina o astemizola) y estimulación de rutas de sistema nervioso periférico y central (Miszkiel et al., 1988a,b). Además, estudios de inhibición de unión con anticuerpo IgE humano dirigido contra el suxametonio (SUX) (de un paciente con una reacción casi fatal) y realizados con cinco compuestos de amonio cuaternario diferentes (QAC)(tres ingredientes comunes de cosméticos y dos desinfestantes de uso común, cetrimida y benzalconio) han mostrado reacción inmunológica cruzada con SUX.
Además, en concentraciones elevadas, todos los QAC provocaron liberación de histamina por parte de basófilos de individuos normales, lo cual sugiere que QAC pueden ser tanto sensibilizadores como liberadores de histamina (Weston and Assem, 1994). Es posible que las propriedades desnaturalizadoras de proteínas de los desinfestantes sean responsables de la sensibilización a través de la creación de neoantígenos de proteínas humanas.
Tal mecanismo también sería responsable del efecto alergénico de desinfestantes distintos químicamente.
Aparte de sus efectos broncoconstrictores, compuestos polares como el cloruro de benzalconio en concentraciones usadas habitualmente en rociadores nasales disminuyen la frecuencia de batido ciliar de tráqueas de embrión de pollo, paladares de rana, y adenoides humanas en un 30 a 50%, 43.5 a 87%, y 35%, respectivamente, después de una exposición de 20 minutos (Berg et al., 1994; Braga et al., 1992; Stanley et al., 1985; Van de Donk et al., 1980, 1982a,b). Este efecto no es reversible aún después de enjuagar con solución Locke-Ringer (Van de Donk et al., 1980, 1982).
El uso a largo plazo del cloruro de benzalconio en el rociador nasal de oximetazolina acentúa la severidad de la rinitis medicamentosa en voluntarios saludables (Graf et al., 1995). A pesar del efecto ciliotóxico observado al exponer epitelio ciliado a preparaciones de cloruro de benzalconio in vitro, estas preparaciones no afectan el despejo nasal o la frecuencia de batido ciliar al ser administradas topicamente a la nariz de individuos normales o de pacientes con rinitis alérgica perenne (Batts et al., 1991; Berg et al., 1995; Braat et al., 1995; Stanley et al., 1985).
De hecho, bajas concentraciones de cloruro de benzalconio (0.01%) fueron bien toleradas en el modelo de paladar de rana, sin cambio significativvo en la velocidad de transporte mucociliar (Braga et al., 1992). Además, se ha demostrado que el cloruro de benzalconio y fosfolipidos activos en superficies con composición similar al surfactante pulmonar reducen la inhibición inducida por ácido del transporte de partícula mucociliar en tráqueas de palomas (Kai et al., 1989).
En contraste con los efectos irritantes y alérgicos descritos anteriormente para el cloruro de benzalconio, la sal de benzalconio en K-ODONTO PLUS no ha producido efecto irritante en pruebas Draize en conejos. Los resultados de K-ODONTO PLUS en estas pruebas son significativos ya que la prueba de Draize continúa siendo el procedimiento legal para evaluar la toxicidad de productos cosméticos, del hogar, químicos, y farmaceuticos.
Al igual que K-ODONTO PLUS, la pentoxifilina, el derivado de metilxantina mencionado anteriormente, inhibe la producción de TNF-a (un mediador crítico en reacciones de irritación inducidas por hapteno y de hipersensibilidad de contacto) y antagoniza la inhibición, mediada por el cloruro de benzalconio, de la liberación de histamina por células mastoideas (ver arriba). La pentoxifilina también suprime la dermatitis inducida por el cloruro de banzalconio (Schwarz et al., 1993).
K-ODONTO PLUS podría tener efectos similares a la pentoxifilina sobre los effectos dañinos del cloruro de benzalconio.
Los efectos de K-ODONTO PLUS sobre la producción de citoquinas descritos anteriormente tambien son consistentes con su falta de efecto irritante. A pesar de las reacciones irritantes y alérgicas inducidas por el cloruro de benzalconio consistan principalmente de linfocitos infiltrados, sin participación de leucocitos polimorfonucleares y números reducidos de alteraciones degenerativas de células de Langerhans (Ferguson et al., 1985; Kolde and Knop, 1987; Willis et al., 1986, 1993), el cloruro de benzalconio también induce un estado de activación metabólica en una alta proporción de células de Langerhans epidérmicas CD1+ (Willis et al., 1990) en el contexto de aposición significativa de linfocito/célula de Langerhans.
En este sentido es diferente a otros irritantes somo el sulfato delaurilo sódico, ditranol, ácido nonanoico, aceite de crotón, y el propilenglicol. La activacion de células CD1+ inducida por sales de benzalconio es relevante a la inmunidad micobacteriana proque las células CD4-CD8- con un receptor de célula T a/b y específicas para CD1 (una familia de glicoproteínas asociadas a la b2-microglobulina, nopolimórficas, no codificada por MHC) reconocen antígenos nopeptídicos bacterianos tales como el ácido micólico (una familia de ácidos grasos de cadena larga ), lipoarabinomanam (LAM), y TUBag4 (un compuesto que contiene timidina trifosforilada en 5') (Beckman et al., 1994; Bendelac et al., 1995; Constant et al., 1995; Sieling et al., 1995).
Además, se ha demostrado que las células T a/b CD4-CD8- expresan altos niveles de Eta-1/osteopontina, una citoquina asociada con resistencia natural a Rickettsia tsutsugamushi, flavivirus, y posiblemente Bartonella bacilliformis (Cáceres-Ríos et al., 1995; Lampe et al., 1991; Patarca et al., 1989, 1990, 1993; Singh et al., 1990). Queda por terminar si K-ODONTO PLUS puede estimular las células CD1+ y la producción de Eta-1/osteopontina.
D. Otros procesos mediados por proteínas G
Como una extensión de la discusión de los efectos de las sales de benzalconio sobre la exocitosis de gránulos, caben mencionar los efectos sobre la herencia vacuolar en levadura. Durante el brote de Saccharomyces cerevisiae, el material de la vacuola materna es entregado a la célula hija en crecimiento a través de estructuras tubulares y vesiculares, y un paso tardío en la herencia vacuolar es la fusión en el brote de las vesículas derivadas de la vacuola materna.
El cloruro de banzalconio, los derivados no hidrolizables de guanosina, y mastoparán, probablemente a través de la interacción con proteínas G, inhibe los eventos de fusión en un sistema in vitro de herencia vacuolar (Haas et al., 1994).
En relación a la función de vesícula endocítica, el cloruro de benzalconio, a través de su efecto sobre una proteína G trimérica que modula la Ca2+-ATPasa, disminuye la toma de 45Ca2+ por vesículas endocíticas en reticulocitos de rata (Vidal et al., 1995). La Ca2+-ATPasa presente en las vesículas endocíticas de reticulocito es probablemente la misma que la bomba de Ca2+ en eritrocitos.
Otros posibles efectos inhibitorios de las sales de benzalconio sobre eritrocitos podrían ser mediados a través de proteínas acopladas a proteína G que unen quimoquinas tal como el antígeno Duffy, el cual media la invasión de eritrocitos por el Plasmodium vivax, uno de los agentes principales causantes de malaria (Horik, 1994; Murphy, 1994).
El antígeno Duffy puede también conferir competencia de fusión entre VIH-1 y células múridas que expresan CD4 humano (Dragic et al., 1996), una observación de relevancia a la actividad inhibitoria potencial de K-ODONTO PLUS sobre la replicación y patogénesis de VIH-1 (ver abajo).
El cloruro de benzalconio bloquea efectivamente la transmisión neuromuscular en ranas, actuando como un antagonista del receptor de acetilcolina en concentraciones bajas (amplitud reducida de potenciales evocados y espontáneos) y como un bloqueador multifocal mas potente en concentraciones superiores (> 1 mM) (aumento en la conductancia en reposo de la membrana de fibra muscular nosináptica) (Takeuchi et al., 1993). El cloruro de benzalconio (10-5 a 10-4 M) suprime la respuesta contráctil de musculatura lisa longitudinal ileal de coballo a la estimulación eléctrica (0.1 Hz, 1 ms) y a la acetilcolina, histamina, y 5-hidroxitriptamina, pero no produce contracción muscular (Primor, 1986).
Aplicación de cloruro de benzalconio a la superficie serosa de yeyuno de rata altera las propiedades eléctricas de mucsculatura lisa, evidenciado como ritmo eléctrico errático y distorcionado y como una alteración en la generación del potential pico (Fox et al., 1983; Fox and Bass, 1984). Por otra parte, la aplicación de cloruro de benzalconio no alteró la propagación del complejo mioeléctrico migratorio (Fox and Bass, 1994).
Estos ultimos resultados sugieren que las neuronas mientéricas juegan un rol modulatorio en la generación y propagación del ritmo eléctrico básico, mientras que factores humorales o las neuronas de la submucosa pueden ser mas importantes en el control del complejo mioeléctrico migratorio (Fox and Bass, 1994). Cabe mencionar tambien que benzalconio, morfina, [Dpro2, Dtrp7,9]sustancia P, y el antagonista de adrenoreceptor-b propranolol reducen, de una manera dosis-dependiente, la relajación, estimulada por campo eléctrico y dependiente de endotelio, de anillos aórticos de conejo precontraídos con fenilefrina (Persico et al., 1993).
Se ha hipotetizado que el mecanismo para este ultimo efecto involucra la liberación de óxido nítrico asociada a adrenoreceptores-b.
Finalmente, se ha demostrado que el cloruro de benzalconio, el mastoparán, el factor natiurético atrial, y el GTP gamma S, a través de interacciones con las subunidades Gs o Gi de proteínas G, estimulan la actividad de guanilato ciclasa en células de tumor Leydig (MA-10) (Khurana and Pandey, 1995).
II. Actividad de disrupción de membrana celular de las sales de benzalconio
A. Actividad espermicida
El cloruro de benzalconio y el nonoxydol-9 son espermicidas benignos (no inducen cambios citológicos en el epitelio cervico-vaginal) y eficientes cuando se usan correctamente durante el acto sexual (Erny and Siborni, 1983, 1987; Frateschi et al., 1990; Mendez et al., 1986; Zufferey, 1985). Estos surfactantes tienen una mayor actividad espermicida (concentraciones de 0.025% inhiben totalmente la mobilidad espermática después de 30 segundos de exposición) que el docusato de sodio y el antiséptico clorhexidina (Chantler et al., 1992; Courtot et al., 1994).
Como detergente catiónico o sapónico y surfactante de la serie amonial, el cloruro de benzalconio rompe la membrana espermática (Meyer et al., 1990). Además, el gel F-5 (que contiene ácido cólico, cloruro de benzalconio, y nonoxydol-9) en la esponja contraceptiva "Protectaid" ejerce una actividad inhibitoria dosis-dependiente sobre la transcriptasa inversa asociada con VIH-1 en un sistema acelular, y sobre el potencial de VIH-1 de infestar eficientemente linfocitos humanos (Psychoyos et al., 1993).
Los estudios conducidos en Italia desde 1983 hasta 1986 (Fratschi et al., 1990), en España (Mendez et al., 1986), y en Francia (Erny and Siboni, 1983) mostraron que el cloruro de benzalconio en una esponja, supositorio, o tampón (cilindros de polivinil suave) es un contraceptivo que es también útil en la prevención de enfermedades transmitidas sexualmente.
Un estudio en Alemania, conducido entre Marzo de 1986 y Diciembre de 1987, fue inconcluso porque la liberación del espermicida de la esponja no era confiable (Meyer et al., 1990). Una ventaja del cloruro de benzalconio es que, a diferencia del nonoxydol-9, no es absorbido a través de la pared vaginal, tal como se ha demostrado en pruebas en mujeres y ratas (Zufferey, 1985). En tal sentido, cabe resaltar que la dosis a la cual el cloruro de benzalconio puede ser embricida y fetocida en la rata es aproximadamente 143 veces superior a la recomendada para controlar la concepción en mujeres (Buttar, 1985; Momma et al., 1987).
B. Actividad anti-VIH directa
Varias actividades inhibitorias de VIH-1 posibles de K-ODONTO PLUS y otras sales de benzalconio han sido menciondas hasta ahora: (1) K-ODONTO PLUS inhibe la proliferación de células T sin alterar las proporciones de linfocitos CD4+ y CD8+, (2) VIH-1 usa proteínas acopladas a proteínas G como cofactores de entrada a las células T CD4+ y a los monocitos, y las sales de benzalconio, incluyendo K-ODONTO PLUS, interactúan con proteínas G; (3) K-ODONTO PLUS inhibe la producción de TNF-a, una citoquina que estimula la actividad linfoproliferativa de célula T y la replicación de VIH. Además, Wainberg et al. (1990) mostraron que el cloruro de benzalconio, usado en concentraciones de 0.05% y superiores, puede ejercer un efecto inhibitorio directo sobre la actividad de transcriptasa inversa de VIH-1.
La exposición de VIH-1 al cloruro de benzalconio a concentraciones superiores al 0.05% destruye la infestividad viral de células blanco susceptibles. Wainberg et al. (1990) también demostraron que VIH-1, presente en secreciones seminales y genitales, puede ser inactivado en tales fluídos por exposición directa al cloruro de benzalconio. Estas ultimas observaciones (resumidas en la Figura 7 como segmentos del ciclo de vida de VIH potencialmente sensibles a las sales de benzalconio), junto con la actividad espermicida de las sales de benzalconio y la ausencia de efecto irritante de K-ODONTO PLUS, favorecen el uso de la sal de benzalconio en K-ODONTO PLUS a la concentración adecuada como contraceptivo y como arma contra los agentes involucrados en enfermedades transmitidas sexualmente como VIH, papilomavirus y herpesvirus y sus neoplasias asociadas.
Experimentos para probar la efectividad de preparaciones similares a K-ODONTO PLUS como agentes contraceptivos y antimicrobianos en la mucosa vaginal están en progreso.
Sin embargo, no existen estándares reconocidos internacionalmente para probar la efectividad de desinfestantes químicos contra virus (Moss, 1994; Weiler et al., 1993). En Europa, los protocolos de DVV (1984) y AFNOR (1989) son utilizados ampliamente para determinar actividad viricida. Relativamente fáciles de usar y bien caracterizados, el virus del polio y el adenovirus son frecuentemente escogidos como virus de prueba. Las pruebas viricidas con VIH presentan varias dificultades técnicas que difieren de aquéllas encontradas con otros virus.
VIH crece lentamente y alcanza solo títulos moderados; en contraste al virus de polio, la inactivación demostrada como inhibición del efecto citopático no es definitiva. Además, el virus asociado a la célula es mas resistente a la desinfección que el virus libre de célula (Sattar and Springthorpe, 1991; Springthorpe and Sattar, 1990). De hecho, las numerosas cepas y quasi-especies de VIH (Bolognesi, 1990; Couillin et al., 1994; Dai et al., 1992; Deacon et al., 1995; Johnson et al., 1992; Koenig et al., 1995; LaRosa et al., 1990; Lee et al., 1995; Meier et al., 1995; Nowak et al., 1991, 1995; Patarca and Haseltine, 1986; Phillips et al., 1991) pueden ser diferentemente susceptibles a inactivación por un biocida selecto.
Por tanto, en estudios publicados sobre desinfección de VIH, los métodos usados para confirmar la pérdida de infestividad viral incluyen efecto citopático y ensayos de producción de transcriptasa inversa o antígeno p24 (Sattar and Springthorpe, 1991); sin embargo, no se ha reconocido un procedimiento modelo.
En general, el criterio aceptado para eficacia viricida es una reducción de 4.0 log10 en los niveles de infestividad viral (AFNOR, 1989; DVV, 1984), pero Sattar y Springthorpe (1991) han sugerido una reducción de 3.0 log10 como medida adecuada de eficacia del producto. Un obstáculo para demostrar consistentemente estos nivels de inactivación es la citotoxicidad inducida por el desinfestante. Varios grupos han tratado de sortear esta dificultad.
El mas sencillo de estos intentos ha sido la dilución de la mezcla virus-desinfestante en medio de cultivo de tejido, pero este enfoque requiere virus en títulos lo suficientemente altos (generalmente > 107 ID50.ml-1) para alcanzar la reducción en infestividad requerida sobre el trasfondo citotóxico. Otros métodos sugeridos incluyen la neutralización usando leche descremada (Drulak et al., 1978), caldo léteo (Gaustad et al., 1974), o remoción del biocida antes del ensayo viral (AFNOR, 1989). Tales métodos, sin embargo, frecuentemente involucran la filtración por gel la cual es onerosa en cuanto a tiempo y usualmente inapropiada para desinfestantes o virus. Otro enfoque ha sido el uso de una técnica de lavado sencilla para remover efectivamente la citotoxicidad pero reteniendo, a la vez, la infestividad de las mezclas desinfestante-VIH.
A través de estos ultimos medios, Gordon et al. (1993) demostró que una solución al 2% de Sactimed-I-Steril, la cual contiene 0.15% de formaldehido y otros agentes, incluyendo compuestos de amonio cuaternarios, penetraron la cubierta lipídica de VIH y contribuyeron a la inactivación del virus. Otros grupos también han reportado sobre los efectos desinfestantes del formaldehido y los compuestos de amonio cuaternarios usados en los compuestos Sactimed (Martin et al., 1985; Quinnan et al., 1986; Resnick et al., 1986; Spire et al., 1984).
C. Otra actividad antiviral directa
Se ha demostrado qie la exposición al cloruro de benzalconio (0.05%) por 10 minutos conlleva a una reducción de más de 99.95% en la infestividad de muestras de virus con cubierta (virus de Sendai y el virus del moquillo canino), una efectividad similar a aquélla alcanzada con radiación ultravioleta (Watanabe et al., 1989). A pesar de que también se ha demostrado que el cloruro de benzalconio inactiva a los coronavirus (virus de la hepatitis de ratón y el coronavirus canino) (Saknimit et al., 1988) y al Herpesvirus hominis, no afecta al virus de la influenza y a los enterovirus (Moldenhauer, 1984). Similarmente, el cloruro de benzalconio parece menos o no efectivo contra virus de ARN sin cubierta (virus de la encefalomielitis múrida de Theiler y reo virus tipo 3) (Watanabe et al., 1989) y parvovirus (virus de rata Kilham y parvoviurs canino) (Saknimit et al., 1988).
D. Actividad antibacterial
Las Tablas 1 y 2 muestran que K-ODONTO PLUS tiene actividad bactericida en diluciones de hasta 1:10 (1% bromuro de laurildimetilbenzilamonio) , mientras que se requieren condiciones sin diluir (10%) para las actividades esporicida y fungicida. Estas concentraciones son superiores a aquéllas usadas para detectar los efectos de K-ODONTO PLUS sobre la actividad mediada por proteína G (hasta el 0.05%). La actividad antibacterial observada con K-ODONTO PLUS es consistente con observaciones previas con otras sales de benzalconio. En tal sentido, varias especies de Pseudomonas (aeruginosa, cepacia, aureofaciens, y putida) son sensibles al tratamiento con benzalconio (Takeo et al., 1994; Weir et al., 1994).
Se ha demostrado que el benzalconio (10 mg/ml) daña a la membrana citoplasmática, pero no a la externa, de Pseudomonas (Burkholderia) cepacia crecida en medio nutritivo con benzalconio (Richards and Cavill, 1981). La sensibilidad bacteriana varía de acuerdo a la composición del nutriente, y las células desprovistas de magnesio son las mas resistentes (Cozens and Brown, 1983). La resistencia de Pseudomonas aeruginosa al cloruro y bromuro de benzalconio ha sido también reportada (Kurihara et al., 1993; Muszynski and Dlugaszwska, 1994) como resultado del aumento en el contenido de fosfolípido y lípido graso y neutral en la pared celular que probablemente impede la adsorción del cloruro de benzalconio (Sakagami et al., 1989).
La ultima conclusión es apoyada por la observación de que plásmidos juegan un rol en la resistancia a desinfestantes por parte de Achromobacter xylosoxidans y de Pseudomonas cepacia (Nagai ad Ogase, 1990). A pesar de que un estudio de 580 bacilos Gram-negativo hospitalarios en Francia reveló la ausencia de cepas de Pseudomonas aeruginosa resistentes al cloruro de benzalconio, se encontró que 4%de las Enterobacteriaceae eran resistentes a este desinfestante (89.5% de Proteus y solo 1.8% de otros bacilos) (Girardo et al., 1989).
Sin embargo, la incidencia de resistencia al cloruro de benzalconio era menor que aquélla al digluconato de clorhexidina (18.2% Enterobacteriaceae resistentes con 94.2% de Proteus) (Girardo et al., 1989).
El benzalkonio es efectivo en la destrucción de Staphylococcus aureus (Palmberg et al., 1994; Platt and Bucknall, 1984; Pons et al., 1992; Yasuda et al., 1993), pero la resistencia a este antiséptico ha sido reportada. A diferencia del caso con Pseudomonas, la resistencia antiséptica en Staphylococcus es consistente con determinantes genéticos codificados en plásmidos (Pereira and Siqueira-Junior, 1995) y ha sido asociada con el gen qacA (Behr et al., 1994). Sin embargo, la resistencia bacteriana a desinfestantes individuales puede ser superada usando mezclas de los mismos (Gismondo et al., 1995).
La exposición al cloruro de benzalconio en fosfato trisódico (Zephiran-TSP) es tóxica (reducción de 104 ó más después de tratamiento por 30 minutos) para aislados de Nocardia (Murray et al., 1987, 1988). El cloruro de benzalconio (1:50.000) también es efectivo en la destrucción de cepas de Campylobacter jejuni aisladas en un intervalo de 5 minutos de heces de gallina (Diker et al., 1987). A pesar de que el cloruro de benzalconio es efectivo en la destrucción de Escherichia coli (McCarthy and Ferreira, 1990; Pons et al., 1992) y de Actinobacillus pleuropneumoniae serotipo 1 (ATCC 4074) (Gutierrez et al., 1995), no afecta la infestividad de las esporas de Bacillus piliformis (Ganaway, 1980).
El cloruro de benzalconio ha sido también utilizado para la desinfección de la piel. La piel no puede ser esterilizada pues aproximadamente el 20% de la flora residente está más allá del alcance de los cepillos y antisépticos quirúrgicos. La meta de la preparación quirúrgica de la piel con antisépticos es la remoción de microorganismos transitorios y patogénicos de la superficie de la piel y de reducir la flora residente a un nivel bajo. A pesar de que el cloruro de benzalconio es algo inestable en la piel (Bourlioux et al., 1983) y susceptible a contaminación (Sebben, 1983), los ultimos dos fenómenos no impiden el uso de las sales de benzalconio para propósitos desinfestantes porque la actividad antibacteriana varía con la estructura de la sal, tal como se discutió anteriormente (Altomare et al., 1992; Furuta and Kihara, 1992; Jono et al., 1985, 1986).
Por ejemplo, las sales de amonio cuaternarias ([N-alquil-N-2-hidroxietil-N,N-dimetilamonio etilo fosfato (21,22), isopropil fosfato (23), n-butil fosfato (24); N-alquil-N-2-hidroxi-3-fenoxipropil-N,N-dimetilamonio etil fosfato (25,26), isopropil fosfato (27), n-butil fosfato (28); bis(N-alquil-N-2-hidroxi-3-fenoxipropil-N,N-dimetilamonio) malato (29), fumarato (30), succinato (31), adipato (32); y N-alquil-N-2-hidroxi-3-fenoxipropil-N,N-dimetilamonio tartrato (33)]), sintetizadas por alquilación de las sales trialquilamonio correspondientes con varios compuestos epoxi, mostraron actividades bactericidas mucho mas superiores que aquélla del cloruro de benzalconio (Makino et al., 1992).
Además, el efecto de la longitud de la cadena alquilo sobre la actividad antibaceriana es ilustrada por la observación de que los homólogos dodecil de N-alquil-N-(2-hidroxi-3-fenoxi)propil-N,N-dimetilamonio butil fosfato y de N-alquil-N-(2-hidroxi-3-fenoxi)propil-N,N-dimetialamonio cloruro tienen prácticamente la misma actividad antibacteriana que la de benzalconio, mientras que los homólogos hexadecil muestran actividad antibacteriana insuficiente (Makino et al., 1994).
En un modelo experimental de sepsis de herida, la irrigación de heridas con cloruro de benzalconio y, en un menor grado la povidona-iodo, redujo significativamente la tasa de infección con Staphylococcus aureus contaminante, pero ambos antisépticos eran inferiores al gluconato de clorhexidina, el cual eliminaba todos los signos aparentes de infección (Platt and Bucknall, 1984). En otro estudio, se encontró que un cepillo de clorhexidina era superior a uno basado en cloruro de benzalconio (Enjalbert et al., 1984), aunque otro estudio de preparaciones desinfestantes rápidas de mano en la unidad de cuidado intensivo no mostró diferencia significativa (Tanaka et al., 1988).
Ademas, el lavado de las manos con cloruro de benzalconio-alcohol era recomendado fuertemente para la prevención de la transmisión de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina porque mostró una actividad desinfestante alta a pesar de una baja actividad bactericida in vitro (Motai et al., 1992) y proveyó excelente actividad antiséptica (94.1% de reducción bacterial) (Minakuchi et al., 1993).
Entre los estudios sobre tejidos aparte de la piel, una comparación ciega de diferentes tipos de pasta dental mostró que una pasta basada en azuleno, cloruro de sodio, y cloruro de benzalconio tendía a producir una reducción marcada en el índice gingival, mientras una pasta basada en clorhexidina producía una reducción mas marcada en el índice de placa (Sortino and Rapisarda, 1980). Consistente con estos ultimos resultados y con las observaciones descritas anteriormente en piel, otro estudio encontró que la clorhexidina era mas efectiva que el cloruro de banzalconio (1 mM) y que la piperazina (1 mM) en la inhibición de la acidogenicidad en placa dental (Opperman, 1980).
El cloruro de benzalconio y la clorhexidina eran tan efectivos en la actividad antiplaca como un antibiótico glicoproteido de Actinoplanes sp. (Pallanza et al., 1984), y se encontró que la irrigación intracrevicular con cloruro de benzalconio reducía significativamente el número relativo de bacterias y el procentaje de espiroquetas en comparación con condiciones pre-irrigación. Sin embargo, las ultimas diferencias no persistieron después de 7 días (Hagiwara et al., 1989).
A pesar de las limitaciones documentadas en algunos de los estudios resumidos anteriormente, un sondeo reveló que el cloruro de benzalconio era la sustancia mas ampliamente usada en Italia para la desinfección del campo quirúrgico, heridas, excoriaciones, yagas, la piel antes de inyecciones, instrumentos quirúrgicos, aparatos médicos, catéteres, termómetros, e instrumentos sanitarios, mientras que la clorhexidina era preferida para la desinfección de las manos y superficies ambientales en combinación con cetrimida (Finzi et al., 1982; Riolo et al., 1982; Scheda et al., 1988).
En el sur de Italia, en contraste con Italia entera y el norte de Italia, el cloruro de benzalconio se usaba más para la desinfección y limpieza de servicios sanitarios, instrumentos y equipos con fibras ópticas (Bergamini et al., 1982; Finzi et al., 1982). Los mejores resultados de desinfección en un estudio italiano fueron obtenidos con una solución hidro-alcohólica de 0.2% de cloruro de benzalconio y 0.15% de 1-benzil-3-[3-dimetilamoniopropoxy]-1 H indazol HCl (Riolo et al., 1982).
Cabe mencionar en esta discusión sobre desinfección que el uso inapropiado de desinfestantes también juega un papel importante en la transmisión nosocomial de patógenos microbianos (Zaidi et al., 1995), tal como lo ilustran los siguientes reportes: un caso de transmisión de Serratia marcescens en un hospital veterinario causado por cloruro de benzalconio contaminado (Fox et al., 1981); un caso de meningitis por Serratia marcescens asociada a una solución contaminada de cloruro de benzalconio (Sautter et al., 1984); un reporte de artritis séptica epidémica por Serratia marcescens asociado con un antiséptico de cloruro de benzalconio contaminado (Nakashima et al., 1987a,b); contaminación con Serratia marcescens de una solución de lentes de contacto conteniendo cloruro de benzalconio (Gandhi et al., 1993); un brote de colonización e infección de tracto respiratorio por Pseudomonas (Burkholderia) cepacia asociada con terapia de albuterol nebulizado (Hamill et al., 1995); transmisión de VIH en un centro de diálisis Colombiano debido al reprocesamiento indebido de agujas de acceso con una solución de bajo nivel de desinfestante con cloruro de benzalconio (Velandia et al., 1995); y un brote de hepatitis B en una clínica de acupuntura asociado con la reutilización de agujas después de inmersión por la noche en una solución 1:750 de cloruro de benzalconio (Stryker et al., 1986).
Sin embargo, de ha demostrado que soluciones oftálmicas preservadas con cloruro de benzalconio se esterilizan rápida y efectivamente después de contaminación con Pseudomonas aeruginosa o con Staphylococcus aureus (Palmberg et al., 1994).
La desinfección de piel de la espalada ha sido recomendada cuando un cateter epidural está presente in situ por motivos anestésicos o para el tratamiento del dolor agudo (Sakuragi et al., 1990), y compresas de benzalconio han sido recomendadas después de quemaduras con ácido hidrofluórico por algunos (Flood, 1988) pero no todos (Bracken et al., 1985) los autores. Además de la desinfección externa, el cloruro de benzalconio tiene muchas aplicaciones clínicas y de laboratorio relacionadas con sus actividades biocidas. Por ejemplo, una solución de cloruro de benzalconio al 1% es efectiva en la desinfección de broncofibroscopios (Ovchinnikov et al., 1990), y K-ODONTO PLUS es efectivo en la desinfección de equipo endoscópico.
El cloruro de benzalconio es también utilizado como ancla catiónica para el bondeo nocovalente de antibióticos aniónicos a ingertos de politetrafluoroetileno como base para la prevención de infecciones prostéticas vasculares (Greco and Harvey, 1982; Greco et al., 1982; Harvey and Greco, 1981; Harvey et al., 1982), y el cloruro de benzalconio es un vehículo apropiado para la preservación del antibiótico cefuroxima en formulaciones oftálmicas (Barnes and Nash, 1994). Similarmente, el cloruro de benzalconio es usado durante el proceso de bondeo en la mayoría de catéteres venosos centrales y umbilicales acoplados a heparina (Sampath et al., 1995) donde ayuda a prevenir la colonización microbiana (Tebss and Elliott, 1993, 1994).
En relación a esta ultima aplicación, cabe mencionar que el cloruro de benzalconio liberado de estos catéteres puede ocasionar hipernatremia e hiperkalemia artificiales (Gaylord et al., 1991). En tal sentido, la heparina benzalconio en catéteres aumenta falsamente las mediciones de sodio con el instrumento Kodak Ektachem y de potasio con tres instrumentos (Beckman Astra, Baxter Paramax, y el Instrumentation Laboratory Monarch) los cuales utilizan electrodos selectivos a iones para medir potasio en suero diluído (Koch and Cook, 1990).
Tres instrumentos que usan electrodos selectivos a iones para medir electrolitos en suero directamente -DuPont Dimension, Abbott Spectrum, y Kodak Ectachem- no sufrían de interferencia en las mediciones de potasio. La interferencia del benzalconio con las mediciones de potasio puede, por tanto, resultar de la interacción con las membranas del electrodo, la cual es acentuada en suero diluído (Koch and Cook, 1990).
En relación a las aplicaciones de laboratorio, cabe también mencionar que el cloruro de benzalconio es recomendado como precipitante proteico para las estimaciones automatizadas por nefelometría de niveles de proteína en líquido cefaloraquídeo y orina (Shephard and Whiting, 1992).
E. Actividad antifungal
Tal como lo muestra la Tabla 2, y consistente con reportes previos sobre las sales e benzalconio, K-ODONTO PLUS es también efectivo como agente fungicida cuando se usa sin diluir (10% bromuro de laurildimetilbenzilamonio).
A pesar de que la decontaminación con cloruro de benzalconio, la cual reduce la supervivencia a niveles mucho menores que los que se obtienen con 1% NaOH, ha fallado en la eliminación de muchos hongos (Brooks et al., 1984), y se ha reportado la supervivencia de Candida albicans en ciertas soluciones de lentes de contacto (May et al., 1995), varias cepas de Candida albicans (incluyendo DSM 1836, ATCC 10231, CNCM 1180-79, y CBS 562) son sensibles al cloruro de benzalconio (Hegna y Clausen, 1988; Van de Voorde et al., 1987).
El cloruro de benzalconio es también útil como agente de resistotipeo en la discriminación del origen profundo o superficial de infecciones de cepas de Candida albicans (Hunter, 1995). Además, una ventaja del cloruro de benzalconio sobre la povidona iodo y el poloxamero es que retiene la actividad fungistática hacia Torulopsis glabrata en medio acídico (Darbord et al., 1987).
F. Actividad antiparasítica
El cloruro de benzalconio (0.001%, 0.004%, y 0.005%) es efectivo en la desinfección de quistes y trofozoitos de Acanthamoeba castellanii y Acanthamoeba polyphaga (Moore, 1990; Silvany et al., 1991), aunque una solución oftálmica basada en cloruro de benzalconio era efectiva solo contra trofozoitos (Zanetti et al., 1995). El cloruro de benzalconio era también uno de los agentes mas efectivos en la eliminación de Microsporum canis aislado de material infestado naturalmente (Rycroft and McLay, 1991), pero se colocaba como segundo al formol (0.1%) en la reducción de la parasitemia de Ascogregarina chagasi en colonias de laboratorio de Lutzomyia longipalpis (Dougherty and Ward, 1991).
G. Otros efectos relacionados a membranas celulares
El cloruro de benzalconio en un acelerador de la tasa de disolución de colesterol, el cual funciona a través de la reducción de la barrera interfacial que existe entre la micela de ácido biliar caragada negativamente y la superficie de colesterol biliar cargado positivamente, una reacción que probablemente se cumple a través de la unión del acelerador cargado positivamente con las micelas cargadas negativamente (Feld et al., 1982; King et al., 1985). Además, el bromuro de hexadeciltrimetilamonio tiene una actividad de disociación de hexámeros de insulina la cual es similar a aquélla de diferentes especies de sales biliares (Shao et al., 1993), y el bromuro de cetiltrimetilamonio catiónico aumenta la absorción intestinal posiblemente a través de la formación de complejos micelares (Kimura et al., 1985).
La inserción de los amfifilos catiónicos bromuro de dodeciltrimetilamonio y polimixina B dentro del sarcolema de miocitos cardíacos tiene un profundo efecto inhibitorio sobre la pérdida de calcio. En contraposición, el amfifilo aniónico sulfato de dodecilo sódico tiene el efecto contrario, y el amfifilo neutral acetato de laurilo no tiene efecto. Estos ultimos resultados sugieren que una alteración en la carga de la superficie del sarcolema afecta la pérdida de calcio, probablemente a través de canales de pérdida de calcio (Clague et al., 1993). La entrada excesiva de calcio es importante en el daño irreversible de los miocitos cardíacos y de otros tipos celulares.
Los surfactantes catiónicos como el cloruro de benzalconio y el cloruro de benzetonio son parte de un grupo de sustancias perturbadoras de membran no específicas las cuales causan daño neurológico, habiéndose reportado casos de intoxicación con cloruro de benzalconio en Japón (Akutsu et al., 1989) y Holanda (Van Berkel and de Wolff, 1988). El cloruro de benzalconio reduce significativamente el número de células ganglionales en el plexo mientérico de duodeno, yeyuno ó ileo de rata al ser aplicado a superficies serosas (Cracco and Filogamo, 1993; Fox et al., 1983; Fox and Bass, 1984; Holle, 1991; Jodal et al., 1993; Ramalho et al., 1993, 1994; See et al., 1992; Zucoloto et al., 1991) y resulta en aganglionosis esofágica, clínicamente similar a la acalasia, al ser aplicado (concentracion: 0.5%) al esófago de ratas Sprague Dawley (Goto and Grosfel, 1989).
Además, se han demostrado resultados comparables a vagotomía proximal gástrica o de célula parietal a través de inyección endoscópica del quimoneurolítico cloruro de benzalconio en un modelo porcino (Neuberger et al., 1994; Schneider et al., 1992), y se ha observado una semejanza cercana en estructura fina entre colon agangliónico producido en ratas por aplicación serosa de cloruro de benzalconio al 0.1% y el colon descendente agangliónico o segmentos mas proximales en la enfermedad de Hirschprung's (Furuta et al., 1980; Inoue et al., 1995; Kunieda et al., 1981).
Se ha demostrado que el tratamiento con cloruro de benzalconio elimina la habilidad de la toxina del cólera de inducir secreción intestitnal, probablemente porque todas las fibras aferentes en el reflejo secretorio intramural activado por la toxina del cólera son canalizados por el plexo mientérico, el cual funciona como centro integrador en el sistema nervioso entérico (Jodal et al., 1993). También se ha demostrado que la denervación mientérica es acompañada por hipersensibilidad a los agonistas de acetilcolina la cual es causada por un aumento en el número de receptores de acetilcolina muscarínicos y por una disminución en la actividad de la acetilcolinesterasa (Inoue et al., 1995).
En animales, tratados con cloruro de benzalconio, se han localizado numerosos grupos esféricos o en forma de huso de neuronas a lo largo de los nervios, posiblemente como reflejo de un intento de reinervación, por fuentes extra-entéricas, de los segmentos intestinales dañados (Cracco and Filogamo, 1993).
Se ha demostrado que la denervación mientérica aumenta el alto de los vellos, la profundidad de las criptas, y el grosor de la capa muscular propria, especialmente en la capa de músculo longitudinal, lo cual sugiere una mayor sensibilidad de esta capa a la denervación mientérica (Hadzijahic et al., 1993; Ramalho et al., 1994). Esta ultima observación es consistente con la inhibición inducida por cloruro de benzalconio de la respuesta contráctil de la musculatura lisa longitudinal ileal de coballo discutida anteriormente (Primor, 1986). Concentraciones mayores de los agentes catiónicos cloruro de benzalconio (>0.1%) y cloruro de benzetonio causaron daño tisular generalizado, incluendo la disrupción de la musculatura lisa, infiltración linfocítica, perforación intestinal, y muertes en ratas (Fox et al., 1983).
En relación a otros efectos relacionados a células nerviosas, se ha demostrado que la introducción de 0.1% de cloruro de benzalconio o benzatonio a la membrana timpánica de coballos causa daño a los receptores neuroepiteliales (zonas vestibulares y cocleares del oído interno) (Aursnes, 1982a,b). Sin embargo, las soluciones antimicrobianas tópicas son usadas comúnmente en la prevención o tratamiento de la otorrea purulenta y en la desinfección del espacio del oído medio antes de cirugía (Federspil, 1984).
A pesar de que la toxicidad ocular ha sido reportada como una reacción al cloruro de benzalconio, ésta no se ha observado con K-ODONTO PLUS. Estudios de microscopía electrónica de barrido han demostrado que el cloruro de benzalconio, en concentraciones entre 0.001% y 0.01%, causa un incremento progresivo en el daño celular y en la pérdida de microvellosidades de superficies en corneas de conejo y gato (Berdy et al., 1992; Burstein, 1980, 1985; Keller et al., 1980; Maudgal et al., 1981; Yang et al., 1985). Se han observado efectos similares usando microscopía confocal de barrido Tandem (Ichijima et al., 1992), mediciones de actividades de dehidrogenasa de lactato y malato y niveles de albumina en lágrimas (Imayasu et al., 1992, 1994), e, in vitro, en células de cultivadas de cornea (Adams et al., 1992; Lapalus et al., 1990; Tripathi et al., 1992; Vaughan and Porter, 1993).
El cloruro de benzalconio (1% pero no menos) provocó un incremento en el grosor de la cornea (Santoul et al., 1990) y una disminución en las superficies de área de las corneas (Doughty , 1994) en conejos. A pesar de que el cloruro de benzalconio (0.01%) aplicado cuatro veces al día a epitelio queratectomizado de cornea de conejo no afectó significativamente la recuperación de la cornea y las tasas de migración epitelial en un estudio (Collin and Grabsch, 1982), otros estudios en conejos y coballos mostraron recuperación afectada (Kossendrup et al., 1985, 1986; O'Brien et al., 1982).
Los conejos, sin embargo, son mas sensibles que los humanos a las aplicaciones de cloruro de benzalconio (Burstein, 1984; De Jong et al., 1994; Durand-Cavagna et al., 1989; Lee and Lee, 1993; Podder et al., 1992; Sasaki et al., 1995; Ubels et al., 1995). Además, se ha demostrado que el cloruro de benzalconio no afecta la morfología in vivo de la célula endotelial de cornea humana (Alanko and Airaksinen,1 983) a menos de que la barrera epitelial anterior este dañada (Collin and Carroll, 1986). El requerimiento de una barrera epitelial rota es ilustrado por el daño endotelial de cornea, requeriendo transplante de cornea causado por el uso frecuente prolongado de medicamentos topicos con cloruro de benzalconio, en un paciente con keratoconjuntivitis sicca y enfermedad de superficie ocular marcada (Lemp and Zimmerman, 1988).
El cloruro de benzalconio está asociado mas comúnmente con el síndrome de ojo seco (Kuppens et al., 1995; Singh and Kaur, 1992) y aumenta la permeabilidad de cornea en pacientes de ojo seco (Gobbels and Spitzna, 1992). Además, un estudio encontró expresión anormal de marcadores inflamatorios sin inflamación clínica a nivel de las células conjuntivas en contacto repetido con varios tratamientos antiglaucomatosos y su preservativo común el cloruro de benzalconio (Baudouin et al., 1994). Otros estudios han encontrado grados significativos de metaplasia conjuntival e incrementos leves en el grosor del colágeno subconjuntival en pacientes en terapia antiglaucomatosa a largo plazo (Kneer et al., 1993; Mietz et al., 1994).
Sin embargo, se ha econtrado que las suspensiones oftálmicas son seguras, independientemente de la presencia de cloruro de benzalconio, para uso en el tratamiento de glaucoma e hipertensión ocular (Denis et al., 1993).
K-ODONTO PLUS no ha afectado las corneas de conejo y por tanto no se espera que tenga efectos nocivos sobre las corneas humans debido a la menor sensibilidad de las últimas. Debido a que los experimentos de toxicidad ocular con K-ODONTO PLUS se realizaron en conejos albinos,es necesario confirmar estos resultados en estudios con conejos pigmentados, los cuales son mas sensibles.
Por ejemplo, el cloruro de benzalconio (0.007%) es citotóxico a células conjuntivas humanas de Chang en cultivo (Takahashi, 1982, 1983), e inyecciones subconjuntivales diarias de cloruro de benzalconio en conejos produjeron, en conejos pigmentados pero no albinos, después de 1 semana, una reducción marcada en las amplitudes de onda a y b en electrorinogramas y, después de 2 semanas, desprendimiento de retina, pérdida de células de visión, y atrofia del epitelio pigmentado retinal y del coroide (Chou et al., 1985).
A pesar de que el cloruro de benzalconio puede acumularse en pigmentos oculares (Chou et al., 1985) y dañar la retina, este efecto es aparente solamente con inyecciones subconjuntivales y no con aplicaciones tópicas.
III. Estudios futuros
Basado en las observaciones discutidas en este reporte, la sal de benzalconio en K-ODONTO PLUS, en concentraciones apropiadas, tiene muchas aplicaciones clínicas, incluyendo su posible uso como contraceptivo con actividad contra microbios los cuales son etiológicos para enfermedades transmitidas sexualmente, tales como las neoplasias y otras enfermedades asociadas a VIH-1, papiloma y herpesvirus, y como agente antiproliferativo y desinfectante de la piel, ojo e instrumentos. Estudios futuros sobre las aplicaciones de la sal de benzalconio en K-ODONTO PLUS requerirán de determinación de la absorción, farmacoquinética, y farmacodinámica de las sales de benzalconio en sistemas corporales.
Estas ultimas determinaciones, al igual que el control de calidad del producto, requieren de la abilidad de detectar y medir los niveles de sales de benzalconio en diferentes compartimientos del cuerpo. Métodos usados para la detección y cuantificación de cloruro de benzalconio en suspensiones y fluidos biológicos incluyen: cromatografía líquida de alta presión de fase reversa (Bleau and Desaulniers, 1989; Elrod et al., 1992; Euerby, 1985; Fan and Wall, 1993; Gomez-Gomar et al., 1990; Meyer, 1980, Santoni et al., 1994); titrimetría de filtrado Kalzman (Li et al., 1990), y microdeterminación potenciométrica (Pinzauti et al., 1981); espectroscopía de masa de ionización química (Daoud et al., 1983); cromatografía de gases (Cybulski, 1984; Suzuki et al., 1989); isotacoforesis capilar (Jannasch, 1985); extracción líquido-líquido de inyección de flujo (Halvax et al., 1990); luminiscencia disminuída en un sistema sensor microbiano que utiliza una membrana con bacterias luminosas y un fotomultiplicador (Lee et al., 1992); espectrofotometría ultravioleta de derivada de segundo orden (Parkin, 1993); y densitometría de capa fina (Paesen et al., 1994).
A pesar de que estudios preliminares han demostrado que la inyección de K-ODONTO PLUS en ratones no está asociado con toxicidad sistémica aparente, se deben realizar estudios adicionales sobre la toxicidad de K-ODONTO PLUS.
COPIA DE EDICION POR EL AUTOR
PUBLICADA EN IDIOMA INGLES:
CRITICAL REVIEWS IN ONCOGENESIS 6(3-6):327-356 (1995).
TRABAJO REALIZADO PARA ANTONIO GASIA.
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